Fundamentos da Purificação de Vírus por Ultracentrifugação

Escola de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas da Universidade de Nagasaki
Epidemiologia Molecular
Professor: Dr. Osamu Nakagomi

Nos últimos anos, na pesquisa de vírus, tornou-se uma prática padrão purificar e analisar genomas e identificar vírus de amostras usando kits comerciais. Como para os vírus estabelecidos seus genomas já são conhecidos, a identificação do vírus é possível mesmo em um estado misto. No entanto, para realizar uma investigação detalhada sobre a natureza dos vírus, é necessário primeiro refinar as partículas virais para obter um alto nível de materiais purificados. Atualmente, nossa empresa também recebe um número crescente de consultas sobre informações sobre o uso de ultracentrifugação para purificação de vírus. Nesse contexto, perguntamos ao Dr. Osamu Nakagomi, professor da Universidade de Nagasaki, especialista no assunto, sobre os fundamentos da purificação de vírus por ultracentrifugação. Aqui está o trecho da entrevista com o Professor Nakagomi

 

Conte-nos sobre o seu histórico de pesquisa.

Meu campo de pesquisa e especialização é a epidemiologia molecular do rotavírus. O rotavírus A é um dos vírus importantes, pois tem sido a causa mais importante de morte devido à diarreia desidratante aguda em bebês e crianças em todo o mundo. Até a década de 1970, as causas da diarreia infantil eram quase inteiramente desconhecidas. Com a descoberta do rotavírus em 1973, foi finalmente estabelecido como o agente etiológico responsável por metade dos pacientes internados nas enfermarias pediátricas com diarreia. Esta foi uma descoberta histórica na pesquisa de vírus. As vacinas contra o rotavírus foram desenvolvidas e licenciadas em 2006, depois de superar muitos obstáculos, e a Organização Mundial da Saúde recomendou em 2009 que as vacinas contra o rotavírus fossem introduzidas no programa nacional de imunização de todos os países do mundo.

Para falar brevemente sobre o vírus; o rotavírus é um vírus não envelopado que consiste em um genoma que compreende 11 segmentos de RNA de fita dupla (Fig. 1). Como outros vírus de RNA, ele evolui rapidamente e exibe rica diversidade genômica. Não apenas infecta os seres humanos, mas também uma variedade de outros mamíferos e aves. Nos anos 80, pela primeira vez, empregando uma técnica epidemiológica molecular que permite a análise no nível de todo o genoma, conseguimos estabelecer que o rotavírus animal pode ser patogênico e de fato causar doenças em seres humanos. Elucidar como o rotavírus evolui enquanto usa seres humanos e outros animais como hospedeiros e como a infecção se espalha é o núcleo do nosso trabalho de pesquisa. Também estamos investigando quais mudanças provavelmente ocorrerão com o uso mais amplo de vacinas. Basicamente, a análise do genoma viral está no coração do estudo epidemiológico molecular do rotavírus.

Conte-nos sobre o seu histórico de pesquisa.

 
Fig. 1. Estructura de partículas y ARN del genoma del rotavirus

Fig. 1. Estrutura de partículas do rotavírus e RNA do genoma

Esquerda: A partícula intacta possui uma camada externa feita de proteínas vermelhas e azuis e possui uma estrutura de três camadas, por isso é chamada de partícula de camada tripla (TLP); se a casca externa for removida, uma partícula de dupla camada (DLP) com proteínas azuis permanece. Direita: O RNA do genoma do rotavírus é separado em 11 segmentos com padrões característicos mostrados por eletroforese.

 

O diagrama das partículas do rotavírus foi gentilmente fornecido pelo Professor Prasad da Baylor University.

Meu campo de pesquisa e especialização é a epidemiologia molecular do rotavírus. O rotavírus A é um dos vírus importantes, pois tem sido a causa mais importante de morte devido à diarreia desidratante aguda em bebês e crianças em todo o mundo. Até a década de 1970, as causas da diarreia infantil eram quase inteiramente desconhecidas. Com a descoberta do rotavírus em 1973, foi finalmente estabelecido como o agente etiológico responsável por metade dos pacientes internados nas enfermarias pediátricas com diarreia. Esta foi uma descoberta histórica na pesquisa de vírus. As vacinas contra o rotavírus foram desenvolvidas e licenciadas em 2006, depois de superar muitos obstáculos, e a Organização Mundial da Saúde recomendou em 2009 que as vacinas contra o rotavírus fossem introduzidas no programa nacional de imunização de todos os países do mundo.
Para falar brevemente sobre o vírus; o rotavírus é um vírus não envelopado que consiste em um genoma que compreende 11 segmentos de RNA de fita dupla (Fig. 1). Como outros vírus de RNA, ele evolui rapidamente e exibe rica diversidade genômica. Não apenas infecta os seres humanos, mas também uma variedade de outros mamíferos e aves. Nos anos 80, pela primeira vez, empregando uma técnica epidemiológica molecular que permite a análise no nível de todo o genoma, conseguimos estabelecer que o rotavírus animal pode ser patogênico e de fato causar doenças em seres humanos. Elucidar como o rotavírus evolui enquanto usa seres humanos e outros animais como hospedeiros e como a infecção se espalha é o núcleo do nosso trabalho de pesquisa. Também estamos investigando quais mudanças provavelmente ocorrerão com o uso mais amplo de vacinas. Basicamente, a análise do genoma viral está no coração do estudo epidemiológico molecular do rotavírus.

 

Discuta a necessidade de ultracentrifugação na pesquisa de vírus.

Ao extrair o genoma do vírus usando o método clássico, as partículas virais devem primeiro ser purificadas. Em seguida, o genoma do vírus extraído das partículas é examinado. A ultracentrifugação desempenha um papel importante no processo. A purificação das partículas virais possibilita desde o início garantir que estamos lidando com os genomas do rotavírus nas partículas virais.

Atualmente, essa análise é realizada quase todo o tempo após a extração apressada do genoma sem realmente purificar a amostra. Essa prática é comum, uma vez que o genoma do rotavírus está bem estabelecido e é de conhecimento geral que, se o genoma (Fig. 1) característico do rotavírus estiver presente, não há dúvida de que o genoma também está presente nas partículas de rotavírus.

No entanto, suponha, por exemplo, que estamos lidando com o problema de determinar que tipo de organelas das células hospedeiras ou proteínas e genomas virais são agregados em uma célula infectada, a ultracentrifugação se torna indispensável.
Além disso, ao estudar novos vírus, torna-se cada vez mais necessário investigar se o genoma está presente ou não na partícula.
Nesses casos, a purificação com uma ultracentrífuga se torna uma necessidade. As informações sobre a densidade flutuante, tamanho e coeficiente de sedimentação (valor de Svedberg, valor S), que são levadas em consideração na ultracentrifugação, são de fato o aspecto fundamental da virologia que, em conjunto, são chamados de propriedades físico-químicas dos vírus.

 

Forneça-nos descrições sobre a purificação de vírus por ultracentrifugação.

 

Fig. 2. Densidades de orgánulos de virus/células y valores S 1
Fig. 2. Densidades do vírus/organela celular e valores S1

 

Ao purificar o rotavírus em amostras obtidas de pacientes, devemos separar organelas celulares, macromoléculas biológicas e similares do vírus. Isso é possível, pois essas partículas têm uma variedade de tamanhos e densidades. A purificação de vírus por ultracentrifugação utiliza lacunas de densidade nas quais outras partículas não param por usar uma combinação de "centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, que é afetada pelo valor S das partículas" e "centrifugação em equilíbrio de gradiente de densidade de cloreto de césio (ultracentrifugação de equilíbrio de densidade), que é afetada pela densidade flutuante das partículas em um solvente. ”A Fig. 2 mostra a relação entre a densidade de bandas (a densidade na qual as bandas aparecem durante a centrifugação do gradiente de densidade) e o valor S. O vírus está localizado exatamente nas lacunas entre uma variedade de partículas celulares, incluindo microssomos e ribossomos. Os vírus são complexos de proteínas (principalmente com uma densidade flutuante de 1,3 g/cm3) e ácidos nucleicos (principalmente com uma densidade flutuante de 1,7 g/cm3), portanto a densidade flutuante varia de 1,35 a 1,4 g/cm3. Por outro lado, o tamanho dos vírus atinge valores S de 100 a 1.000 S. Os valores S das frações de microssomos se sobrepõem aos dos vírus (eixo horizontal), mas a separação por densidade é possível (eixo vertical). Assim, a separação é realizada usando centrifugação por gradiente de densidade de sacarose, cloreto de césio e similares. As frações de vírus têm densidade mais alta que as frações de microssomos, porque incluem ácidos nucleicos. Além disso, quanto maior o vírus, maior o seu valor S. A ultracentrifugação envolve a purificação combinando esses dois parâmetros, portanto é evidente que está intimamente ligada às propriedades físico-químicas.
A centrífuga também é extremamente importante para discernir essas propriedades físico-químicas. O tamanho também pode ser determinado de forma confiável com um microscópio eletrônico, mas se houver uma nova cepa de vírus, é importante o discernimento de onde o vírus irá parar quando centrifugado. Por exemplo, o influenza e o rotavírus com tamanho moderado de 100 nm, afundarão se girados durante a noite a cerca de 10.000 rotações usando uma centrífuga refrigerada de alta velocidade Avanti. No entanto, o norovírus de 30 nm de tamanho não afunda com a centrífuga Avanti e, nesses casos, é necessária uma ultracentrífuga Optima. Para afundar partículas de 30 nm com uma centrífuga Avanti, a purificação é realizada depois de reduzir o volume, seguindo procedimentos como salgar.

Além disso, quando se trata de volumes de processamento, os seguintes métodos são considerados da ordem do maior para o menor: método de centrifugação diferencial (pellet normal), método de almofada e método de gradiente de densidade. O método de almofada permite que 60-70% do tubo seja preenchido com a amostra, mas o volume é reduzido para 10-15% na centrifugação em gradiente de densidade. Assim, após verificar as características comportamentais das partículas usando o método do gradiente de densidade, o método de almofada é usado para permitir que um maior volume de amostras seja processado. Por exemplo, a partícula de rotavírus passa por uma camada de sacarose a 30%, mas não passa por uma camada de sacarose a 70%, de modo que o vírus pode se concentrar na interface entre as camadas de sacarose a 30% e 70% (Fig. 3).

Conte-nos sobre a purificação ultracentrífuga de um vírus específico.

Rotores de ângulo fixo versus caçamba oscilante

Geralmente, se forem comparados rotores que produzem a mesma força centrífuga, o rotor de ângulo fixo permite que um volume maior seja processado e é mais fácil de usar. No entanto, como os rotores de caçamba oscilante de carregamento superior, como o SW 32 Ti, permitem o carregamento de caçambas a partir do topo, a diferença na facilidade de uso pode ser eliminada. De fato, como os rotores da caçamba oscilante exigem uma tampa no tubo, pode-se argumentar que eles são muito mais fáceis de manusear.
Se você deseja remover com precisão as bandas produzidas por centrifugação em gradiente de densidade, os rotores de caçamba oscilante são os preferidos. Os pellets deixam rastros na superfície da parede com rotores de ângulo fixo, que algumas pessoas podem considerar problemáticos.

Em particular, recentemente, a sensibilidade de detecção da PCR em tempo real aumentou, tornando necessário considerar níveis de contaminação que poderiam ter sido ignorados anteriormente.
Em geral, então, acho que os rotores de ângulo fixo devem ser selecionados se volumes maiores forem necessários, e os rotores de caçamba oscilante devem ser usados se a contaminação for uma grande preocupação.

Preparação de amostra

Explicarei a etapa de preparação da amostra usando a purificação do rotavírus a partir do fluido de cultura infecciosa (ICF) como exemplo. Uma vez que o rendimento de partículas virais purificadas é aproximadamente proporcional ao volume inicial, é preferível usar 1 litro de ICF. 

Entrevista com o Usuário

Depois de um certo grau de concentração foi atingido utilizando uma centrífuga refrigerada de alta velocidade, é ainda mais concentrado e purificado com uma ultracentrífuga do tipo piso usando um rotor de caçamba oscilante SW 32 Ti ou SW 55 Ti. Na minha opinião, o SW 32 Ti é um "rotor dos sonhos" porque seu design facilita o uso. Usamos esse rotor na ultracentrífuga Optima da Beckman Coulter Life Sciences que temos em nosso laboratório. Considero o Optima um parceiro confiável, especialmente toda vez que o executo da noite para o dia. Sei que sempre posso confiar e confiar no dia seguinte para obter os resultados esperados. E nunca fiquei desapontado.
A Fig. 3 é o nosso protocolo para purificar o rotavírus do ICF.
Inicialmente, para eliminar detritos celulares, 1 litro de ICF é dividido em 6 frascos que são centrifugados por 10 minutos a 15.000 xg usando um rotor de ângulo fixo JA-14. Esta etapa pode ser omitida, mas, se feito, haverá mais impurezas durante a ultracentrifugação com o método de almofada na próxima etapa. Quanto mais o pré-tratamento, mais fáceis e limpas serão as operações subsequentes. 

Além disso, se houver uma grande quantidade de impurezas, o vírus fica enredado nelas, o que pode diminuir o rendimento.
Após remover os detritos celulares, o sobrenadante restante é sujeito a centrifugação adicional por 14 a 16 horas a 30.000 xg usando um rotor de ângulo fixo JA-14 para obter os pellets onde estão os vírus. Se você estiver com pressa, poderá usar uma ultracentrífuga e processar 300 mL de cada vez com um rotor de ângulo fixo Tipo 45 Ti. Você pode centrifugar rapidamente essas amostras a 30.000 rpm por 2 horas ou a 40.000 rpm por 1,5 horas.
Em seguida, suspenda os pellets em 26 mL de solução fisiológica tamponada com fosfato (PBS). Decidir em que volume de PBS os pellets devem ser suspensos requer experiência e intuição. Em geral, nunca se concentre mais do que 1 a 10 em cada etapa da purificação. Por exemplo, se o seu material de partida for 1 L, você não deve se concentrar abaixo de 100 mL; se você concentrar em, digamos, 10 mL, o produto resultante ficará espesso. Para facilitar o manuseio, você pode optar por concentrações mais altas, mas se arrependerá mais tarde. No entanto, isso é apenas uma regra geral.

Fig. 3. Purificación de rotavirus
Fig. 3. Purificação do rotavírus

Purificação por Ultracentrifugação

As impurezas podem ser removidas ainda mais usando o método de almofada de sacarose com um rotor de caçamba oscilante SW 32 Ti de grande capacidade. As partículas de rotavírus podem ser concentradas na interface entre as camadas de sacarose de 30% (p/v) e 70% (p/v). Para isso, dispense 4,5 mL de solução de sacarose a 70% na base de um tubo de ultracentrífuga de 38,5 mL e aplique uma camada de 6,5 mL de solução de sacarose a 30% no topo, que é então revestida com 26 mL da suspensão viral em PBS. Quando a ultracentrifugação é concluída nas condições indicadas na Fig. 3, as impurezas se acumulam em quantidades maiores acima da camada de solução de sacarose a 30% e as partículas do rotavírus se agrupam entre a almofada de sacarose de 70% e 30% e aparecem como uma faixa branca. A faixa branca pode ser coletada por uma das três maneiras diferentes; inserir diretamente uma seringa na faixa para extrair a faixa branca; coletando a faixa branca após remover as camadas líquidas desnecessárias logo acima dela, ou separando as frações inserindo uma agulha na base do tubo.

Para aumentar ainda mais o grau de pureza, a centrifugação com gradiente de densidade pode ser realizada usando um rotor de caçamba oscilante SW 55 Ti de pequena capacidade. Para isso, dispense a solução de cloreto de césio a 55% (p/v) na base de um tubo de ultracentrífuga de 5 mL e cubra-a com a mesma quantidade de solução de cloreto de césio a 40% (p/v). As gradações de densidade são produzidas por soluções de camadas com densidades diferentes, e esse procedimento geralmente é considerado demorado.

No entanto, um gradiente de densidade pode ser formado naturalmente após a ultracentrifugação, mesmo com apenas duas camadas. Este é um pequeno truque. A camada 0,5-0,8 mL de fração viral bruta obtida pelo método de almofada (neste caso é sempre melhor usar uma pequena quantidade da solução) em cima de uma solução de cloreto de césio e realizar ultracentrifugação por 16-20 horas a 257.000 xg. Dezesseis horas significam iniciar a centrifugação na noite do dia anterior e coletar na manhã seguinte, mas não há necessidade de ser rigoroso quanto à duração.

Como você pode ver na Fig. 3, existem duas faixas visíveis de rotavírus no tubo. A banda superior compreende partículas de camada tripla (TLP) de rotavírus intactas de 1,36 g/cm3 e a banda inferior compreende 1,38 g/cm3 de partículas de camada dupla (DLP) nas quais a casca externa é removida. As partículas virais contêm RNA. A DLP tem menos proteínas que a TLP; portanto, a proporção de ácidos nucleicos é maior e, portanto, mais pesada. A faixa azul acima é composta por partículas vazias constituídas apenas por proteínas sem ácidos nucleicos e, por serem proteínas, a densidade flutuante é de cerca de 1,3 g/cm3. De fato, quando a camada externa da TLP é removida para revelar a DLP, a RNA polimerase é ativada. E em experimentos envolvendo RNA polimerase, é utilizado o rotavírus DLP com a camada externa removida.

Limpeza do rotor

Como o cloreto de césio de alta densidade é usado, é importante lavar cuidadosamente o rotor com água morna após o uso para evitar corrosão do tipo furo de pino.

A equipe do Laboratório de Epidemiologia Molecular

1. Mazzone HM. CRC Handbook of Viruses: Mass-Molecular Weight Value and Related Properties. Boca Raton (FL): CRC Press LLC; 1998.