Experimentos com ultracentrifugação analítica

Velocidade de sedimentação (Sedimentation velocity, SV)

SV é uma técnica dependente do tempo em que partículas de interesse sedimentam ao longo da duração do experimento, em última instância, granulando para o fundo da célula.

Em experimentos de SV, uma solução inicialmente uniforme é colocada na célula, e uma velocidade angular suficientemente alta é usada para causar sedimentação relativamente rápida de soluto em direção ao fundo da célula. Isso produz uma diminuição do soluto perto do menisco, e a formação de um limite acentuado entre a região diminuída e a concentração uniforme de soluto de sedimentação. 

Embora a velocidade das partículas individuais não possa ser resolvida, a taxa de movimento desse limite pode ser mensurada. Isso leva à determinação do coeficiente de sedimentação, s, que depende diretamente da massa das partículas e, inversamente, no coeficiente de fricção, que por sua vez é uma medida eficaz. Isso pode ser representado pela equação:

Fórmula da AUC de imagem de velocidade de sedimentação

A SV geralmente é considerada o principal método de escolha para a maioria das aplicações atuais de AUC, incluindo o estudo da proteína de autoassociação e heteroassociação, o estudo de proteínas de membrana e aplicações em biotecnologia.1

Equilíbrio de sedimentação (Sedimentation equilibrium, SE)

Esta é uma técnica AUC independente do tempo em que a partícula de interesse atinge um estado de equilíbrio na célula centrífuga, e não granula.

Em experimentos de SE, um pequeno volume de uma solução inicialmente uniforme é centrifugado a uma velocidade angular inferior do que é necessário para um experimento de SV. Conforme o soluto começa a sedimentar em direção ao fundo da célula e a concentração no fundo aumenta, o processo de difusão se opõe ao processo de sedimentação. 

Fórmula da AUC de equilíbrio de sedimentação

Finalmente, os dois processos opostos abordam o equilíbrio, e a concentração do soluto aumenta exponencialmente em direção ao fundo da célula. Em equilíbrio, a distribuição de soluto resultante é invariável ao longo do tempo. A medição da concentração em diferentes pontos pode determinar o peso molar do soluto de sedimentação (numericamente igual à massa molecular). Leia mais

 

DEPOIMENTOS

“Devido ao grande tamanho e a heterogeneidade conformacional das nossas amostras, os experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica nos permitiram ter muitos resultados seminais sobre mecanismos de condensação de cromatina que não seriam possíveis com qualquer outra técnica”.

Jeffrey C. Hansen, Ph.D. 
Universidade do Estado do Colorado 

 

Referências

Zhao H, Brautigam CA, Ghirlando R, et al. Métodos atuais em velocidade de sedimentação e sedimentação
Ultracentrifugação analítica de equilíbrio. Curr Protoc Protein Sci 2013;20:2-52.

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