Visão geral de ultracentrifugação analítica

Ultracentrifugação analítica (Analytical ultracentrifugation, AUC) para caracterização de macromoléculas em solução

A ultracentrifugação analítica (Analytical ultracentrifugation, AUC) é a tecnologia mais versátil, rigorosa e precisa disponível para determinar o peso molecular, as propriedades hidrodinâmicas e termodinâmicas de uma proteína ou outra macromolécula. 

Embora a sua história tenha quase um século, a AUC é:

  • Uma técnica autônoma, de primeiro princípio, realizada em um ambiente sem matriz que não requer padrões.
  • Insuperável por outras técnicas no fornecimento da mesma gama de informações com um nível comparável de precisão e exatidão. 
  • O método de padrão de excelência para a determinação do peso molecular da proteína em solução2

AUC 101: fornecendo informações baseadas na velocidade e no equilíbrio

Em contraste com outros métodos utilizados para analisar macromoléculas, a ultracentrifugação analítica (AUC) permite a caracterização de amostras em seu estado nativo em condições de solução biologicamente relevantes. A AUC pode ser usada para investigar quase qualquer tipo de molécula ou partícula em uma ampla gama de concentrações e variedades de solventes. Para muitas perguntas de pesquisa não existe um substituto analítico satisfatório para a AUC.1

A AUC fornece aos pesquisadores duas visões complementares sobre o comportamento da solução. A velocidade de sedimentação fornece informações de primeiro princípio e hidrodinâmicas sobre o tamanho e a forma das moléculas. O equilíbrio de sedimentação fornece o mesmo tipo de informação sobre as massas molares da solução, estequiometrias, constantes de associação e solução não-ideal.

Mais perguntas? Mais respostas.

Em um experimento, a tecnologia AUC pode fornecer mais respostas às perguntas críticas do que qualquer outra técnica comparável:

  • Formato:Quão esférica é a minha proteína?
  • Diâmetro: Qual é o tamanho da minha partícula?
  • Massa: Qual é o peso molecular da minha proteína ou complexo em solução?
  • Estequiometria: Quantas subunidades compreendem minha proteína?
  • Pureza: Existem outras partículas na minha amostra?
  • Formulação: Como minha proteína se comporta neste tampão (buffer)?
  • Heterogeneidade: A minha proteína está ligada a outras moléculas? E qual a configuração do complexo?
  • Agregação: A minha proteína ainda está em uma forma utilizável? Devo esperar uma resposta imune com a minha formulação de medicamentos?
  • Associação: A minha proteína se associa com e/ou se dissocia de outras proteínas?
  • Conformação:  A conformação da minha proteína muda após a ligação a um ligante?

Saiba ainda mais sobre a AUC consultando o nosso manual de Introdução à ultracentrifugação analítica.

Referências

1 Cole JL, Lary JW, Moody T, et al. Ultracentrifugação analítica: Velocidade e equilíbrio de sedimentação. Métodos Cell Biol 2008;84: 143-79.

2 Berkowitz S, Philo J. Caracterizando produtos biofarmacêuticos usando ultracentrifugação analítica. Em: Houde D, Berkowitz S, editores. Caracterização biofísica de proteínas no desenvolvimento de produtos biofarmacêuticos. Amsterdã: Elsevier; 2015. p. 211-260.

 

 

Recursos

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O que é uma ultracentrífuga analítica?

Optima AUCUma ultracentrífuga analítica é semelhante a uma centrífuga preparativa de alta velocidade, exceto pelo fato de que as partículas na amostra que estão sendo centrifugadas são monitoradas em tempo real por um sistema integrado de detecção óptica. Esses sistemas ópticos (absorbância UV-Vis e interferência de Rayleigh) permitem a observação precisa do comportamento da solução das moléculas à medida que sofrem sedimentação. Usando o software de última geração, os dados podem ser usados para uma análise detalhada de moléculas na amostra sendo estudada.

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