Caracterização do vetor viral

As terapias celular e genética envolvem o desenvolvimento de um veículo de transporte de genes para introduzir um medicamento no corpo. Muitas empresas que desenvolvem terapias genéticas estão  trabalhando com vírus adenoassociado (VAA) como seu veículo de transporte de genes de escolha. VAAs são ideais, pois o capsídeo viral pode ser modificado para que ele carregue um produto terapêutico. Os pesquisadores primeiramente precisam determinar qual porcentagem dos seus capsídeos virais está intacta e entender quantos capsídeos virais intactos estão carregados. Essa carga transgênica é fundamental para o sucesso da terapia.

empty capsid, partial capsid, full capsid the ultimate goal viral vector characterization with auc

É particularmente importante que os pesquisadores entendam a carga viral dessas partículas, porque é improvável que as partículas virais que não contêm o gene terapêutico alvo completo produzam atividade terapêutica, em vez disso, esses capsídeos parciais podem produzir reações adversas, como uma resposta imunogênica. Os pesquisadores precisam entender a qualidade e a pureza de uma determinada preparação viral, e muitos estão recorrendo à ultracentrifugação analítica para esse insight.

Uma solução para medir a homogeneidade do vetor rAAV, a pureza (e mais): analisar partículas virais na solução.

Os vetores virais adenoassociados recombinantes (recombinant adeno-associated viral vectors, rAAV) podem ser uma grande promessa para novas terapias genéticas que salvam vidas.

Porém, embora técnicas clássicas como a dispersão dinâmica da luz (dynamic light scattering, DLS) ou a cromatografia líquida de alta eficiência (high performance liquid chromatography, HPLC) possam caracterizar a heterogeneidade e a agregação dos rAAV, elas simplesmente não fornecem resolução suficiente para quantificar a homogeneidade e a carga de partículas virais. Quando se trata de produzir preparações de vetor rAAV de nível clínico, um obstáculo sempre presente é alcançar medições de alta resolução.

Como sabem os pesquisadores de terapias genéticas, com tanto em jogo no desenvolvimento inicial dos produtos, descobrir rapidamente o que pode ou não dar certo é fundamental. A adoção da ultracentrifugação analítica possibilita a produção de vetores rAAV de nível clínico, diferentemente das outras tecnologias usuais. 

Qual é o principal obstáculo? Falta de uma técnica quantitativa de alta resolução para monitorar a qualidade terapêutica em relação a:

  • Homogeneidade
  • Pureza
  • Consistência do produto
  • Plenitude viral 

A solução ideal: análise na solução com ultracentrifugação analítica (AUC).

Cientistas, como os de Genethon, descobriram, ao permitir a análise sem matriz de preparações de vetores rAAV — independentemente do sorotipo e do transgene — que a AUC os ajuda a:

  • Determinar o estado de montagem viral ou homogeneidade 
  • Quantificar a agregação empiricamente
  • Determinar a contaminação de subpartículas
  • Quantifique a massa para medir com precisão a carga genética

Assista a este webinar para saber como Christine Genethon LE BEC e sua equipe usaram com sucesso, uma AUC para caracterizar vetores scAAV e ssAAV — incluindo uma homogeneidade e carga de partículas virais.

Produtos para caracterizar vetores virais

Optima AUC Analytical Ultracentrifuge

Optima AUC

A AUC de última geração frequentemente usada no CQ de vetores virais fornece a quantidade relativa/porcentagem de capsídeos vazios, cheios e parcialmente cheios 
Helpful Links

Analytical Methods to Measure Empty and Full AAV Particles

As gene therapy approaches usually require large amounts of AAV vectors for clinical use, few manufacturing processes have been reported to provide high titer and potent quantities of products. The dose control of AAV vectors is commonly established on titration methods relying either on the quantitation of DNA (viral genome) or transgene expression following cell transduction (infectious genome). However, AAV vector lots are generally a heterogeneous mixture of empty particles (i.e. do not contain DNA) and full particles (i.e. contain DNA). Therefore, it could be considered that empty particles are product related impurities, which can impact on the immunogenicity profile of the product when high doses are administered to patients. Different indirect methods can be used to establish the ratio between full and empty AAV particles. The quantification of full capsids is performed by using qPCR based technology. The total particles can be evaluated by an ELISA assay, spectrometric analysis, ion-exchange chromatography or SDS-PAGE. However, these methods have limitations and are not applicable to all serotypes without performing a new development. Using analytical ultracentrifugation approach, we have developed a method to quantify simultaneously empty and full AAV particles as well as intermediate species containing fragmented or incomplete vector genome. We have applied this technique to AAV lots of different serotypes, several sizes of transgene and different process of production. Several examples of AAV vectors analysis will be presented showing that AUC could be implemented as a routine test to monitor AAV product quality and manufacturing consistency.

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